ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS

Técnica para la separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo de la técnica que se use.

La técnica clásica utiliza una tira recubierta de una sustancia porosa impregnada de un electrolito. Sus extremos se sumergen en dos depósitos independientes que contienen ambos al electrolito y están unidos a los electrodos del generador de corriente. La muestra se deposita en forma de un pequeño trazo transversal en la tira. La distancia de migración se mide en relación un marcador interno. Las placas son reveladas con sales de plata, azul de Coomassie, o reactivos en particular.

La electroforesis capilar (CE) es una técnica de separación que se ha desarrollado gracias a los avances de la cromatografía líquida. Esta técnica permite separar bastante bien biomoléculas, donde la cromatografía líquida se muestra menos eficaz, y compuestos de pequeña masa molecular, difíciles de estudiar por los procedimientos clásicos de electromigración en soporte.

Constituye una adaptación particular de la técnica de electroforesis. Esta técnica separativa se basa en la migración de las especies de la muestra en disolución, portadoras de una carga eléctrica global, bajo el efecto de un campo eléctrico y en contacto con un soporte (medio de desplazamiento) adecuado. la tira se reemplaza por un tubo capilar abierto en sus extremos, fabricado con un diámetro pequeño (15 a 150µm). El capilar oscila entre 20 y 80cm, y está lleno de una solución buffer. Un detector se encuentra ubicado en un extremo del capilar, cerca del compartimiento catódico. La señal obtenida es la base de la obtención del electroferograma, que muestra el registro de la composición de la muestra.

La detección por fluorescencia resulta más sensible si se emplea una fuente láser muy intensa, asociada a menudo a un procedimiento de preformación de derivados de los analitos portadores de un fluoróforo.

OTRAS TÉCNICAS:

• Electroforesis capilar en zona o en disolución libre (CZE).
• Electroforesis capilar electrocinética micelar (MEKC).
• Electroforesis capilar en gel (CGE).
• Isoelectroenfoque capilar (CIEF).

APGAR

La puntuación de APGAR es una prueba para evaluar a recién nacidos poco después de su nacimiento, se le realiza al bebé en dos ocasiones: la primera vez, un minuto después del nacimiento y la segunda cinco minutos después del nacimiento.

1. Aspecto (color de la piel)
2. Pulso (frecuencia cardíaca)
3. Irritabilidad (respuesta refleja) (de Grimace en inglés)
4. Actividad (tono muscular)
5. Respiración (ritmo respiratorio y esfuerzo respiratorio)

Este examen se hace para determinar si un recién nacido necesita ayuda con la respiración o está teniendo problemas cardíacos. 

HEMOFILIA

HEMOFILIA

Hemofilia es una enfermedad de origen genético, recesiva  ligada al cromosoma X, donde se encuentran los genes que codifican los factores hemostáticos VIII y IX.

• Factor VIII (FVIII) en la HA «hemofilia clásica»
• Factor IX (FIX) en la HB o «enfermedad de Christmas».

Alteraciones estructurales o moleculares de dichos genes condicionan una deficiencia cuantitativa o funcional. 

La enfermedad es heredada en el 70% de los casos; en el otro 30% es consecuencia de una mutación de novo.

Estructura y función de los factores VIII y IX

El gen que codifica al factor VIII se localiza en la banda distal del cromosoma X, específi camente en la porción Xq28.4 Este gen tiene una longitud de 186 kilobases (kb) y consta de 26 exones, el cual codifica un ARN mensajero de 9 kb que sintetiza al factor VIII. El factor VIII maduro está integrado por 2332 aminoácidos. En su estructura hay una cadena pesada (compuesta por los dominios A1 y A2) y una cadena ligera (compuesta por los dominios A3, C1 y C2). En el centro del factor VIII hay un dominio B de función desconocida.

Los principales sitios de síntesis del factor VIII son el hígado, el riñón, el bazo y el endotelio de los vasos sanguíneos. El factor VIII es una proteína lábil, susceptible de degradación proteolítica, por tal motivo siempre va unido al factor de von Willebrand, el cual le ofrece resistencia a la degradación proteolítica durante su forma inactiva; cuando el factor VIII se activa, se separa del factor von Willebrand y se convierte en blanco de otros factores de coagulación tales como los factores Xa y IXa, proteína C activada y trombina.

El factor VIII es indispensable para la activación del complejo tenasa por parte de la vía intrínseca de la cascada de coagulación, así como también en el modelo celular de la coagulación, ya que el factor VIII tiene una participación muy importante en la fase de propagación.

Esto explica por qué un paciente con hemofilia A es incapaz de producir cantidades suficientes del factor Xa que puedan sobrepasar la vía del inhibidor del factor tisular y la hemorragia es inevitable.

El gen que codifica al factor IX de la coagulación se encuentra localizado en la banda distal del cromosoma X, específi camente en la porción Xq27. Este gen tiene una longitud de 38 kb y consta de ocho exones y codifica un ARN mensajero de 3 kb que sintetiza al factor IX en forma de una proteína de 415 aminoácidos. El producto final contiene al menos dos regiones importantes dentro de su estructura, una región catalítica, la cual está diseñada para su sitio de unión al factor VIII, y una región Gla, que necesita un proceso de gammacarboxilación para activar al factor IX antes de su unión al factor VIII.

La unión y activación bioquímica del factor VIII con el factor IX se lleva a cabo en la superfi cie de las membranas celulares. A su vez, el factor IX es activado durante la fase de iniciación del modelo celular por el complejo factor tisular-factor VIIa y por el factor XIa en la fase de propagación. Al igual que en la hemofilia A, en la hemofilia B no se pueden producir cantidades suficientes del factor Xa, por la deficiencia del factor IX, y el paciente tiene tendencia a la hemorragia. 

Manifestaciones clínicas

La principal manifestación clínica de la hemofilia es la hemorragia, cuyo grado depende del nivel del factor VIII o IX presente en el plasma. Por la intensidad del sangrado y el nivel del factor, la hemofilia se clasifica en tres tipos: 

• Hemofilia severa (< 1 % de actividad del factor ) 
• Hemofilia moderada (de 1 a 5 % de actividad del factor)
• Hemofilia leve (> 5 % de actividad del factor)

Los individuos con hemofilia severa por lo general experimentan hemorragias repetitivas y espontáneas.

Diagnóstico prenatal y posnatal.

Actualmente se están llevando a cabo técnicas intrauterinas para diagnosticar la hemofilia, tales como la toma de muestras de vellosidad coriónica o de líquido amniótico, para evaluar la actividad del factor VIII.

Tratamiento

El objetivo principal del tratamiento de la hemofilia es prevenir y tratar las hemorragias con el factor deficiente. 

En general, se recomienda el uso de concentrados del factor VIII o IX sobre el uso de plasma fresco congelado o crioprecipitados, debido al riesgo inherente de infecciones relacionadas con la transfusión. 

La desmopresina o los medicamentos antifibrinolíticos son la mejor opción para los pacientes con hemofilia leve.

TRANSCRIPCIÓN

TRANSCRIPCIÓN

La transcripción de los genes que codifican las proteínas mediante RNA polimerasa II, se inicia hacia arriba de la primera secuencia codificante, en el lugar de inicio de la transcripción, el punto que se corresponde con el extremo 5' del producto final de RNA. La síntesis del transcrito primario de RNA se desarrolla en sentido 5' a 3', mientras que la cadena del gen que está siendo transcrito y que sirve de plantilla para el RNA se lee en sentido 3' a 5' con respecto a la dirección del eje de desoxirribosa fosfodiéster. Debido a que el RNA sintetizado se corresponde, tanto en polaridad como en secuencia (sustituyendo U por T), a la cadena 5' a 3' del DNA, esta cadena no transcrita de DNA es denominada algunas veces cadena de DNA codificante o "con sentido".

La cadena de DNA 3' a 5' transcrita se denomina cadena no codificante o "antisentido". La transcripción continúa a través de intrones y exones del gen, mas allá de la posición en el cromosoma  que corresponde al extremo 3' del mRNa maduro. No sabemos si la transcripción finaliza en un punto de terminación 3' predeterminado.

El transcrito primario de RNA es procesado añadiendo una estructura química llamada "caperuza" extremo 5' del RNA y cortando el extremo 3' en un punto específico hacia abajo del final de la información codificante. A este corte le sigue la adición de una cola poli-A en el extremo 3' del RNA, lo que parece incrementar la estabilidad del RNA poliadenilado resultante. La localización del punto de poliadenilación está especificada en parte por la secuencia AAUAAA (o por alguna variante de la misma), que en general se encuentra en la porción 3' no traducida del transcrito de RNA. Todas estas modificaciones postrancripcionales tienen lugar en el núcleo, así como también el proceso de ensamblaje del RNA. El RNA del todo procesado, denominado ahora mRNA, es finalmente transportado al citoplasma, donde se produce la traducción.

POLIPOSIS ADENOMATOSA FAMILIAR

Poliposis adenomatosa familiar

La Poliposis Adenomatosa Familiar (PAF) es una enfermedad hereditaria, de carácter autosómico dominante, de alta penetrancia ocasionada por una mutación en el gen supresor tumoral APC localizado en el brazo largo del cromosoma 5. Representa el 1 al 2% del total de los cánceres colorrectales. Tiene varias formas clínicas, entre ellas la PAF atenuada (menos de 100 pólipos colorrectales sincrónicos), Síndrome de Gardner y el Síndrome de Turcot. Puede ocurrir mutación espontánea aproximadamente en el 20% de los casos. Según el lugar donde se produzca la mutación del gen APC habría una correlación clínica para que la enfermedad sea atenuada o severa y que el comienzo de la misma sea temprano o tardío. La característica principal es el desarrollo de gran cantidad de pólipos adenomatosos en el colon y en el recto, generalmente a partir de la pubertad. Además de la afectación rectocolónica, pueden presentar lesiones extracólicas. De no llevarse a cabo una colectomía profiláctica, 100% de los pacientes desarrollará cáncer colorrectal (CCR) antes de los 50 años. En la actualidad, las opciones quirúrgicas incluyen la proctocolectomía e ileostomía con reservorio ileal y la colectomía total con anastomosis ileorrectal (AIR).

No debemos olvidar, en todos los individuos con Poliposis Adenomatosa Familiar se deben vigilar mediante endoscopia alta, independientemente del tratamiento realizado, las mucosas de riesgo (duodeno, intestino grueso, reservorio ileal, ileostomía), ya que la segunda causa de mortalidad tras el cáncer colorrectal es el carcinoma periampular.

PCR

PCR

DEFINICIÓN

La reacción en cadena de la polimerasa es una reacción enzimática in vitro que amplifica millones de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos en los que la secuencia blanco es copiada fielmente. Para ello, la reacción aprovecha la actividad de la enzima ADN polimerasa que tiene la capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en las células. 

En la reacción, si usamos como sustrato ADN genómico, entonces típicamente hablamos de una PCR, pero si usamos ADN complementario (ADNc) proveniente del ARNm (ácido ribonucleico mensajero) se le conoce como RT-PCR (Reverse Transcription-PCR, por sus siglas en inglés). 

Los elementos importantes en la reacción son el templado o molde (ADN o ADNc), la enzima, los oligonucleótidos o primers, los desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTPs: adenina, timina, citosina y guanina), el ión magnesio (Mg +), una solución amortiguadora o buffer y H2 O. Todos estos elementos interactúan en tres etapas principales de las que se compone la PCR: desnaturalización, hibridación y extensión. 

Los equipos en donde se realiza la reacción son llamados termocicladores, los cuales están diseñados para establecer un sistema homogéneo en donde las condiciones de temperatura y tiempo necesarios no se modifique en cada uno de los ciclos. Al final de la reacción, para corroborar si se amplificó la secuencia blanco de interés, los productos de la PCR o también llamados amplicones son analizados en geles de agarosa para confirmar si la reacción fue exitosa.

ELEMENTOS NECESARIOS:
El elemento principal en la PCR es el ADN, cuya naturaleza química ofrece ventajas para su manipulación.

En la PCR, el templado son las cadenas de ADN que se separan y funcionan como molde para que la enzima sintetice las nuevas cadenas que llevan la secuencia blanco de interés. Por su parte, la ADN polimerasa se encarga de la catálisis de la reacción, sintetizando las nuevas cadenas de ADN que llevan la secuencia blanco. La enzima más usada con frecuencia se llama Taq ADN polimerasa,4 que proviene de una bacteria termófi la llamada Thermus aquaticus, la cual vive en condiciones de temperatura muy altas y por eso su ADN polimerasa es capaz de soportar ese tipo de temperaturas.

El rasgo que distingue a esta enzima bacteriana de otras ADN polimerasas de otros organismos es su capacidad para mantener su funcionalidad a temperaturas altas, por lo que se le considera una enzima termoestable.

Los primers son secuencias de oligonucleótidos que flanquean y delimitan la secuencia blanco que se desea amplifi car y son complementarios a ésta. Generalmente su tamaño oscila entre 15-25 pares de bases y la cantidad de G-C no debe ser más del 55% de la secuencia. Si no se respetan estas reglas, existe la posibilidad de la formación de dímeros de primers, es decir, de productos inespecíficos.

Son dos secuencias diferentes de primers las que se utilizan en la PCR, una denominada «forward» o sentido y otra «reward» o antisentido; ambas deben estar diseñadas para que hibriden con el templado y las cadenas de ADN puedan ser extendidas por la Taq polimerasa en dirección 5’-3 (como sucede endógenamente).  

Por su parte, los dNTP’s son los ladrillos o bases nitrogenadas con los que la Taq polimerasa construye las nuevas cadenas de ADN. Son factores importantes que contribuyen a la especificidad de la reacción, por ello es importante que su concentración sea la adecuada ya que de lo contrario pueden afectar la función de la Taq polimerasa.

También se usan otros buffers de composición distinta que son fácilmente comprados en el mercado. El magnesio es un cofactor enzimático que influye en la especificidad de la reacción, por eso se debe tener una concentración adecuada para que no afecte el rendimiento de la Taq polimerasa.

¿CÓMO FUNCIONA?

Desnaturalización. En esta etapa, las cadenas de ADN son calentadas y separadas a una temperatura de 95 °C durante 20-30 segundos; el tiempo depende de la secuencia del templado, es decir, si la cantidad de G-C es alta, será necesario más tiempo para romper sus uniones debido a que el apareamiento de estas bases está formado por tres enlaces, uno más que las bases de A-T. 

Hibridación. En esta etapa, los primers se alinean al extremo 3’ del templado previamente separado e hibridan con su secuencia complementaria. Para que se forme el complejo templado-primers, es importante que la temperatura de hibridación o temperatura melting (Tm) sea la óptima; ésta generalmente oscila entre 50-60 °C. Si el diseño de los primers es el correcto y la temperatura es la adecuada, la estabilidad y especifi cidad del complejo será eficiente. 

Extensión. En esta etapa, la Taq polimerasa actúa sobre el complejo templado-primers y empieza su función catalítica a una velocidad muy rápida; agrega dNTP’s complementarios para crear las cadenas completas de ADN. La extensión de las cadenas es en dirección de la síntesis del ADN, es decir, de 5’ a 3’.La temperatura óptima para la reacción es de 72 °C, ya que a esa temperatura la enzima es funcional.

PRODUCTO FINAL

Al final de la PCR, para saber si la reacción transcurrió eficientemente, los amplicones son visualizados a través de una electroforesis en geles de agarosa. La electroforesis consiste en la separación de grandes moléculas como los ácidos nucleicos a través de una matriz sólida que funciona como un filtro para separar las moléculas en un campo eléctrico de acuerdo a su tamaño y carga eléctrica. Esta separación se hace bajo un buffer o tampón que puede ser TAE o TBE.

En el caso de los ácidos nucleicos, el grupo fosfato les proporciona la carga negativa, por lo que durante la electroforesis migran hacia el polo positivo. Para ello, se prepara un gel diluyendo una cantidad de agarosa en el buffer, se calienta hasta que la agarosa hierva lo sufi ciente y posteriormente se vacía a un recipiente que sirve de base para que solidifi que.

Otro ingrediente que se agrega al gel es un compuesto conocido como bromuro de etidio, una molécula intercalante capaz de unirse al ADN de doble cadena. Cuando es excitado con luz UV emite una señal que permite la visualización de los amplicones en forma de bandas.

Cuando los amplicones son corridos en el gel, éstos deben ser cargados junto con un marcador molecular que contenga un número determinado de segmentos de ADN conocidos, lo que facilita la identifi cación de los amplicones y si su tamaño corresponde con el esperado. 

Finalmente, la visualización de los amplicones se lleva a cabo tomando una foto digital al gel de agarosa expuesto a luz UV. 

CONCEPTOS DE PATRONES DE HERENCIA

Conceptos

Alelo: copia alternativa de un gen

Haplotipo: conjunto de alelos en el locus

Loci: conjunto de un gen

Locus: sitios iguales de un gen

Autosomico: mutación entre 1 a 22 cromosomas, los otros 2 restantes son sexuales

Dominante: un cromosoma es portador de un alelo anómalo y otro normal

Recesivo: los dos alelos son anómalos

Homocigoto: alelos iguales

Heterocigoto: alelos diferentes

Hemicigoto: solo posee un alelo en lugar de 2

No penetrancia: individuo es portador de la mutación pero no la expresa

Penetrancia: la mutación se expresa

Expresividad variable: gravedad de la enfermedad que depende del genoma o del medio ambiente

Mosaicismo: individuo con mas de una linea celular, hay células con mutación

Mosaicismo germinal: afectación por alteración de gónadas en los padres

Mutación de novo: individuo con primera aparición de la enfermedad, por edad avanzada de la madre

Mutación genética: afectación por edad avanzada del padre

Consanguinidad: los dos progenitores tienen un alelo mutante si están relacionados geneticamente entre si

Endogamia: selección de parejas de la misma población